北 虫 草 液 体 培 养 基 配 方 的 优 化

北 虫 草 液 体 培 养 基 配 方 的 优 化

邹湘月1，2罗巍1，2吴郑武1，2刘东波1，2谢红旗1，3*

（1 湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙410128；2 国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南长沙410128； 3 湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南长沙 410128）

摘 要 以发酵液中北虫草生物量、胞内胞外多糖含量为指标，筛选出最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为麸皮，KH2PO4 和 ZnSO4 为最适无机盐。通过三因素三水平的正交实验，优化出北虫草菌丝生物量及多糖得率的液体发酵培养基，最佳配方为玉米粉 4.8%，麸皮 0.6%，KH2PO4 0.05%，ZnSO4·7 H2O 0.1%。

关键词 北冬虫夏草 培养基 多糖得率 优化

文章编号 1000-8357（2012）04-0010-03

分光光度计（U-1800 型）日本岛津公司；其他为实验室常规设备。

1.1.3培养基固体培养基（PDA）：马铃薯汁 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，酵 母膏 1.0 g/L，蛋 白胨 2.0 g/L，KH2PO4    1.0 g/L， MgSO4 0.5 g/L，VBl 0.02 g/L，琼脂 20 g/L，pH 6.7，121℃ 0.1 MPa蒸汽灭菌 30 min，用于菌种活化培养。

种子液体培养基：KH2PO4   3.0 g/L，MgSO4   1.5 g/L，蛋白胨

北虫草（Cordyceps militaris L.Link），又称北冬虫夏草，俗称蛹虫草，是冬虫夏草种的一种[1]。

近年来，人们在北冬虫夏草适宜生长条件的选择及控制、液体菌种代替固体菌种等种植技术方面取得了系列成就，特别是液体发酵技术的深入研究，能够快速地生产药食用菌的真菌菌丝体，降低杂菌感染，提高有效成分含量，大大缩短了传统固体培养时间，有效节约生产成本[5]，[6]。目前，对北冬虫夏草液体菌种的适宜碳源、氮源及其配方的报道较多[7]-[9]，但是充分考虑培养基成分对菌种生物量、细胞内外多糖含量影响的系统性研究却甚少。研究通过系列对比试

验，探讨不同碳源、氮源及其无机化合物对上述 3 种指标的影响，为生产实践中的液体菌种制备研究出可靠的相关技术参数；通过正交实验，优化出有利于菌丝胞内外多糖累积的最

佳培养基配方，为北虫草的液体发酵生产提供借鉴参考。

材料与方法

供试材料

供试菌种由湖南农业大学食用菌研究所提供。

试剂和器材葡萄糖、蔗糖、KH2PO4、MgSO·7 H2O、 FeSO4·7 H2O 、CaCl2·H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4 和NH4NO3 均为分析纯试剂；酵母膏和蛋白胨均为生化试剂；玉米粉、麸皮和豆饼粉均为煮沸 30 min 后四层纱布滤过液。

立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50FAS），上海申安医疗器

械厂；超净工作台（SW-CJ-2F 型），苏州净化设备有限公司； 恒温培养振荡器（ZHWY-2102C 型），上海制成分析仪器制造有限公司；电热鼓风干燥箱（101-4AB 型），北京中兴伟业仪器有限公司；恒温水浴锅（DK-S24），上海精宏实验设备有限公司；台式离心机（KA-1000 型），上海安亭科学仪器厂；紫外

收稿日期：2012-02-28

基金项目：湖南农业大学人才基金（08 YJ15）；湖南省教育厅科学研究项目（09 C499）；作物种质创新与资源利用重点实验室科学基金开放项目（10 kfxm11）。

*通讯作者。e-mail：xiehongqi2006@sohu.com

10 g/L，葡萄糖 20 g/L，pH 6.7，高压蒸汽灭菌 30 min。

基本发酵液体培养基：KH2PO4   1.0 g/L，MgSO4·7 H2   O 0.05 g/L，氮源 6.0 g/L，碳源 36 g/L，pH 6.7，在 121℃ 0.1 MPa 高

压蒸汽下灭菌 30 min。

培养方法

各培养基培养方法 固体培养：将保存的菌种接种于固体培养基，置于 24℃恒温培养 7~10 d[10]，备用。

种子液培养：将活化的菌种接种于种子培养基中，25℃、

120 r/min 于恒温培养振荡器中黑暗培养7~8 d 至菌种成熟[11]。发酵培养：按 4％（体积分数）的接种量将培养好的液体

种子接种到发酵培养基中，24℃、120 r/min，恒温振荡黑暗培养 8~10 d[12]。

液体发酵培养基的筛选试验

碳源的确定 在基本发酵液体培养基中。碳源分别用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、麸皮代替，质量分数为3.6％，pH 6.7。每组设 3 个重复，液体发酵培养。

氮源的确定 在基本发酵液体培养基中.氮源分别

用蛋白胨、酵母膏、麸皮、豆饼粉、硝酸铵代替，质量分数为

0.6％，pH 6.7。每组设 3 个重复，液体发酵培养。

无机化合物的确定 在基本培养基中分别加入KH2PO4、MgSO4·7 H2O、FeSO4·7 H2O、ZnSO4·7 H2O、MnSO4· H2O、CaCl2·H2O 每种无机化合物的添加量为质量分数 0.1％， pH 6.7。每组设 3 个重复，液体发酵培养。

测定方法

菌丝体生物量的测定   将发酵液抽滤得到菌丝体滤饼，收集上清液和沉淀的菌丝体，用蒸馏水洗后，再离心，直至上清液不再带有培养基的颜色为止。收集菌丝体，置于 60℃ 干燥箱中干燥至恒重，在干燥器中冷却到常温，称重。

虫草胞外多糖提取 北虫草液体摇瓶发酵液经 4 层纱布过滤，将得到的滤液进一步用滤纸过滤，取滤液10 mL，加 4 倍体积的 95%乙醇，于 4℃下醇沉 24 h，在转速为 3 000 r/min条件下离心 15 min，沉淀多糖用蒸馏水复溶后于 4℃下保存。

虫草胞内多糖提取准确称取干燥的虫草菌丝体

1.00 g，加蒸馏水 30 mL，于 90℃提取 2 h，趁热过滤，滤渣加蒸5 70

馏水 30 mL，于 90℃水浴浸提 2 h，合并滤液，定容至 100 mL. 60

取溶液 10 mL，加 4 倍体积 95%乙醇，于 4℃下醇沉 24 h，离心， 50

沉淀加适量蒸馏水于 4℃下保存。3

多糖的测定多糖采用苯酚 浓硫酸法测定[13]。

正交实验依据北虫草发酵生长需要的营养需求和实2

验的可行性，按照 1.2.2 筛选出的培养基的各个成分，采用120

L（9    33）正交表，对发酵培养基进行三因素三水平的正交实0 10

验。优化出液体发酵培养基的最佳搭配方案。表 1 为正交实验的因素与水平的选择。

表 1     正交实验L（9     33）因素和水平

水平    碳源/%氮源/%无机盐/%

10

1. 葡萄糖；2. 蔗糖；3. 麸皮；4. 玉米粉；5. 可溶性淀粉

图 2 不同碳源对北冬虫夏草多糖含量的影响

25

12.4

23.6

0.6

1.2

KH2PO4 0.05%+ ZnSO4·7H20 0.05%

KH2PO4 0.05%+ ZnSO4·7H20 0.1%

    34.81.8KH2PO4 0.05%+ ZnSO4·7H20 0.15%

结果与分析

碳源的选择

碳源对北虫草菌丝体生物量的影响碳源是北虫草合成碳水化合物及氨基酸的基础，实验结果表明（图 1 所示）， 5 种不同碳源都能被北虫草不同程度利用，以蔗糖做碳源时， 菌丝体干重达最大值 25.6 g/L，葡萄糖、玉米粉次之，其次为

15

10

5

1. 1蛋白胨；2. 酵2母膏；3. 豆饼3粉；4. 麸皮；54. 硝酸铵5

图 3 不同氮源对北冬虫夏草菌丝体生物量的影响

可溶性淀粉，麸皮最差，约为蔗糖碳源的 30%。这一结果进一步证明了北虫草菌丝体的液体发酵对蔗糖等小分子糖类的利用率较高。

30

25

20

15

10

5

0

很大的选择性[14]。由图 3 可知，以有机氮作为北冬虫夏草液体发酵的氮源，其生物量优于无机氮源，各有机氮源之间的差别并不显著。其中，蛋白胨作为氮源时，生物量最高，达到

19.9 g/L，约为以硝酸铵作氮源时的 2 倍。加入硝酸铵的液体培养基中生物量最低，可能是因为酸性盐的使用导致发酵液pH 降低得过快，不能为北虫草提供适宜的发酵环境从而抑制了菌丝体的生长[7]。

2.2.2氮源对北虫草菌丝体胞外多糖和胞内多糖得率的影响由图 4 可知，从多糖方面考虑，酵母浸膏作为氮源，其菌丝体中的胞外多糖含量可达 1.426 mg/mL；以麸皮作为氮源，菌丝体中胞内多糖含量为 38.6 mg/g；较差的是硝酸铵。从氮

1. 葡1 萄糖；2. 蔗糖2 ；3. 麸皮；4.3玉米粉；5. 可4溶性淀粉   5

图 1 不同碳源对北冬虫夏草菌丝体生物量的影响

2.1.2 碳源对北虫草菌丝体胞外多糖和胞内多糖得率的影响   多糖是菌丝体细胞壁的主要成分之一，当碳源不适时合成速率降低从而导致多糖得率的下降。图 2 可见从多糖方面考虑，以麸皮作为碳源的胞外多糖含量较高，为 3.0764 mg/ mL，玉米粉次之；以玉米粉作为碳源时的胞内多糖含量较高，达到 50.79 mg/g，约为葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖碳源的 4 至 5倍。综合考虑生物量及多糖含量影响因素，采用玉米粉作为

北虫草液体发酵的碳源。该结果与王永敏[14]等人得出的蔗糖为蛹虫草发酵条件的最适碳源有所区别，这可能是因为北冬虫夏草的菌种不同所致。

氮源的选择

氮源对北虫草菌丝体生物量的影响氮源是北虫草自身合成蛋白质及核酸的必需元素，菌丝体对氮源的利用有

源的影响因素来看，麸皮对胞内和胞外多糖的合成有明显的促进作用。综合考虑上述影响及经济原则，选用麸皮为北虫草发酵的最佳氮源。

2.0

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

010

蛋白胨；2. 酵母膏；3. 豆饼粉；4. 麸皮；5. 硝酸铵

图 4 不同氮源对北冬虫夏草多糖含量的影响

无机化合物的选择

无机盐对北虫草菌丝体生物量的影响试验结果表

明（图 5），各种无机盐都对北冬虫夏草菌丝体生物量有促进作用，说明这些无机成分是北冬虫夏草菌丝生长的必不可少

的成分。其影响效果依次是：1.ZnSO4；2.KH2PO4；3.FeSO4；4.

KB 中K1 为最大值，KC 中K2 最大，所以 A 因素选水平 3，B 因素选水平 1，理论上 C 因素可选任一水平。在本正交实验计划表中A3B1C（2    玉米粉 4.8%，麸皮 0.6%，KH2PO4 0.05%，ZnSO4.7

CaCl2；5.MnSO4；6.MgSO4。其中 Zn2+对北冬虫夏草菌丝体生长影响较大，生物量可达 14.5 g/L，从北冬虫夏草菌丝体生物量考虑，选择 KH2PO4 和ZnSO4 作为北冬虫夏草菌丝体液体发酵

H2O 0.1%）为最优方案，其菌丝体胞外和胞内多糖含量分别达到了 3.1 mg/mL 和 50.1 mg/g。

表 2 胞外多糖正交试验直观分析表

的无机盐。

16

14

12

10

8

磷酸二氢钾；2.硫酸镁；3.硫酸亚铁；4.硫酸锌；5.氯化钙；6.硫酸锰

图 5 不同无机盐对北冬虫夏草菌丝体生物量的影响

无机盐对北虫草菌丝体胞外多糖和胞内多糖得率的

影响     如图 6 所示，添加 Zn2 + 有利于北冬虫夏草发酵液和菌

处理A

玉米粉/%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

K1

K2

K3

k11.13

k22.13

k32.83

B

麸皮/%

1

2

3

1

2

3

1

2

3

7.2

6.6

4.5

2.2

1.5

C

无机盐/%

1.3

2

3

2

3

1

3

1

2

5.6

6.8

5.9

1.87

2.27

1.97

胞外多糖

（/ mg.mL-1）

1.5

0.6

2.8

2.2

1.4

3.1

2.9

丝体内多糖的积累，其含量分别是0.65 mg/mL，32.9 mg/g；对北冬虫草菌丝体胞内胞外多糖含量影响排序依次是：硫酸锌>

    R1.7

表 3 胞内多糖正交试验直观分析表

硫酸亚铁>磷酸二氢钾>硫酸镁>氯化钙>硫酸锰。从北冬虫夏草菌丝体胞外和胞内多糖含量考虑，选择 KH2PO4 和ZnSO4作为北冬虫夏草菌丝体液体发酵的无机盐。

处理A

玉米粉/%

1

2

B

麸皮/%

1

2

C

无机盐/%

1

2

胞内多

糖（/   mg.g-1） 18.9

23.0

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

40

30

20

10

10

3

4

5

6

7

8

9

K1

K2

K3136.0

3

1

2

3

1

2

3

114.3

104.8

68.8

3

2

3

1

3

1

2

87.6

107.5

92.8

7.6

45.3

35.1

22.0

50.1

46.7

39.2

1.磷酸二氢钾；2.硫酸镁；3.硫酸亚铁；4.硫酸锌；5.氯化钙；6.硫酸锰k1

图 6 不同无机盐对北冬虫夏草中多糖含量的影响

2.4正交实验结果分别以提高北虫草发酵液中多糖和菌k3

16.5

34.1

45.3

38.1

34.9

22.9

29.2

35.8

30.9

丝体内多糖含量为实验目的，对培养基成分进行的三因素三水平的正交实验，结果见表 2。由直观分析表（表 3）可知，三

R2.04

表 4 胞外多糖正交实验方差分析表

偏差平方和自由度均方F 值F

因素对胞外和胞内多糖含量的影响大小次序相同，都是碳源

＞氮源＞无机盐。极差R 最大的是A 因素（胞外：1.7；胞内：B

28.8），其次为 B 因素（胞外 0.9；胞内 15.2），最后是 C 因素（胞C

4.38

1.34

0.26

22.19

20.67

20.13

219

67

13

0.05

19

19

19

0.01

99

99

99

外 0.4；胞内 6.6）。极差越大说明该因素的变动对结果的影响越大，即碳源是最重要的影响因素。由方差分析结果（表 4） 可知，两指标实验的 A 因素都达到差异极显著（P＜0.01），B

e0.0220.01

表5    胞内多糖正交实验方差分析表

偏差平方和自由度均方F 值F0.05F0.01

因素都达到差异显著（0.01＜P＜0.05），而 C 因素差异不显著A

（P＞0.05），此结论与直观分析表所得结果基本一致并说明B

了A 和B 因素应选取最优水平，因素 C 选取任一水平对实验C

1267.0

383.5

70.5

2633.5

2191.8

235.3

145.919

44.219

8.1319

结果影响不明显。因此从表 2 和表 3 结果得出，KA 中K3 最大，

   e8.6724.34

（下转 P31）

轻，就不要碰打催菇，只是轻拿轻放，剥掉外袋即可。

头潮菇迟迟不出或出菇过少

培菌管理因素培菌管理如果通风不良，有轻度烧棒， 或在缺氧下呼吸代谢，菌棒内有机酸积累过量，对菌丝有伤害作用，导致出菇困难。措施是加强菇棚通风，控制菇棚内温差（白天盖棚，晚间揭棚）1 周左右出菇转为正常。

菌棒过重出菇困难 催菇时要重碰重催，只要一个菌

棒能出 2~3 个香菇，菌棒的通透性将得到改善，很快菌棒就能转轻，出菇转为正常。

转色迟缓造成菌膜过厚   在第三次刺孔时，因温湿度适宜菌丝旺长而不倒伏，菌棒转色过迟菌膜过厚造成出菇困难。措施：促使转色应及时提高湿度，迫使菌丝早倒伏。催菇操作上应重碰重催，如果不行，应采用诱导催菇方法，可用

柴油和食用醋 1∶1 的比例，5 000 棒各 500 g，加热熏蒸，待柴

油和食用醋完全蒸发后再延长盖棚 12 h。此方法是在其他方法不能奏效时使用，因为该方法催菇畸形菇较多，催菇时应该注意诱导剂的用量，量大畸形菇多且畸形严重应慎用。

光照因素   光照过暗也影响正常出菇，要根据天气情况灵活掌握，及时调整遮阳网层数。

温度因素 催菇后气温上升也影响出菇，所以应在当地温度稳定在 15~22℃催菇较安全，选择晴天温差大于 8℃催菇效果较好。

死菇蕾

温度因素 在气温不稳定的情况下，催出菇蕾，如气温

上升易出现死菇蕾现象，防范方法同 3.5。

越夏管理因素   越夏管理如通风不良，易出现只出菇蕾不长菇现象，现蕾后绝大部分菇蕾死掉，这种现象对产量影响较重，应加强菇棚通风，继续养菌一段时间后还不能正常出菇时，同 3.3 诱导出菇。

菇脚过长

长菇脚对生物产量没有影响，但对经济产量影响是很明显的（主要是干菇），同时影响鲜菇商品质量，产生原因主要是温度和光照。

温度因素   温度主要是影响头潮菇，应选择适宜催菇时间，温度较高，菇脚较长，适宜催菇温度同 3.5。

光照因素   光照不足，菇脚较长，越阴暗菇脚越长，适宜温度正常催菇时应去掉一层遮阳网（网高度低于 3 m 除外），到冬至前后应去掉另一层网，开春后根据气温变化适时

掌握，因为温度也影响菇脚长短，在整个生产过程中应将温度和遮阳综合考虑。

转潮迟缓

菇棚结构不合理不利通风，或菇棚很少通风（在通风不良情况下），由于前潮菇已大量消耗菌丝，而菌丝恢复生长很慢，导致菌棒受损，只要通过加强通风，一周即可慢慢缓解。头潮菇过密造成菌棒受损，应加强通风，这比上述情况

要严重，所以不要急于催第二潮菇，一定要待菌棒恢复养菌以后（手捏菌棒较硬）再催第二潮菇，否则对后潮的产量影响很大

（上接P12）

3结论与讨论

对碳氮源的筛选结果表明，北冬虫夏草可利用的碳氮源比较广泛，对碳源来说，北虫草对双糖、单糖、有机碳源有较好利用。对于氮源来说，北虫夏草对有机氮源和天然氮源的利用较好。适量的无机盐可以促进北冬虫夏草菌丝体的生长和胞外胞内多糖的积累，并得出适合北冬虫草液体发酵的最优培养基搭配方案为玉米粉 4.8% ，麸 皮 0.6% ， KH PO 0.05%，ZnSO·7H O 0.1%。另外，胞内外多糖含量不

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2

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随生物量的增加而增加，且两者间相关性不明显。但是，研

究仅对培养基进行了优化，要使北虫草多糖的含量进一步提高，还必须对培养条件，包括培养温度、时间、转速、装液量、起始 pH，接种量等因素进行优化，还有待于进一步研究。

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