灵芝单核和双核菌丝培养条件的比较研究发表时间：2023-08-24 11:33 DOI:10.13629/j.cnki.53-1054.2011.03.005 中国食用菌 2011， 30 （3）： 18~20， 23 EDIBLE FUNGI OF CHINA CN53－1054 ／ Q ISSN 1003－8310 〈育种与驯化〉 灵芝单核和双核菌丝培养条件的比较研究* 陈裕新 1，2， 夏志兰 1，2**， 刘东波 1，2， 康信聪 1，2， 熊兴耀 1，3 （1.湖南农业大学园艺园林学院， 湖南 长沙 410128； 2.国家中医药管理局亚健康干预技术实验室， 湖南 长沙 410128； 3.湖南农业大学生物质能源研究中心， 湖南 长沙 410128） 摘要： 研究不同培养条件对灵芝单核、双核菌株生长的影响，并分析其对环境适应力的差异。不同单核菌株间生长势出现一定程度的差异性，单核菌丝在水分、温度、pH 值的适应能力上弱于双核菌丝，但在光照适应性上强于双核菌丝，单核菌丝生长势总体上弱于双核菌丝。灵芝单核、双核菌株都存在吐水现象，但单核对水分更敏感。灵芝单核菌 株与双核菌株在水分、温度、pH、光照上都存在较大环境适应力差异，双核菌株对环境适应能力要强于单核菌株。 关键词： 单核菌丝；双核菌丝；培养条件；吐水现象；环境适应力 中图分类号： S646.9 文献标识码： A 文章编号： 1003-8310 （2011） 03-0018-04 Comparison for Mononuclear and Dicaryotic Mycelium Culture Conditions of Ganoderma lucidum CHEN Yu-xin1,2, XIA Zhi-lan1,2, LIU Dong-bo1,2, KANG Xin-cong1,2， XIONG Xing-yao1,3 (1.Hunan Agricultural University, Horticulture and Landscape College, Changsha Hunan 410128; 2.State Administration of Traditional Chinese Medicine, State Key Laboratory of Subhealth Intervention Technology, Changsha Hunan 410128; 3.Bioenergy Research Center, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128) Abstract: The growth in different culture conditions of mononuclear mycelia and dicaryotic mycelium of Ganoderma lu- cidum were compared and the differences of environmental adaptation were analyzed. The differences were existed in the growth rate of mononuclear mycelium in different strains. The adaptability in water, temperature and pH of mononuclear mycelium were weaker than that of dicaryotic mycelium while the adaptability in illumination intensity was opposite. The growth vigor of mononuclear mycelium was weaker than that of dicaryotic mycelium. Spiting water phenomenon was exist- ed in both mononuclear and dicaryotic strains, however, the mononuclear mycelium were more sensitive to water. The dif- ferences of environmental adaptation in water, temperature, pH, and illumination intensity were existed in mononuclear and dicaryotic mycelium of Ganoderma lucidum. The environmental adaptive ability of dicaryotic mycelium was stronger than that of mononuclear mycelium. Key words: Mononuclear mycelium; Dicaryotic mycelium; Culture condition; Spiting water phenomenon; Environmental adaptive ability 灵芝 （Ganoderma lucidum） 属真菌界、 担子菌亚门、层菌纲、 非褶菌目、 灵芝科、 灵芝属， 为大型的药用真菌。 有着 “仙草” 的美誉， 是名贵的药材， 被广泛应用于药品和食品中， 具有益心气、 益肺气、 安神补肝、 坚筋骨、 通九窍等多种药效， 同时还兼有养生美容， 延年益寿的功效[1]。 单核菌丝又名初生菌丝， 是由孢子直接萌发形成的菌丝， 每个细胞内只有 1 个细胞核； 双核菌丝又称次生菌丝， 是由二条遗传性状不同的异质菌丝相互融合而成， 每个细胞内有 2 个细胞核， 具有锁状联合， 是形成子实体的菌丝形态。 分离单核菌株是大型真菌杂交育种的必经之路[2，3]，同时也研究担子真菌极性、 结合方式和交配型基因及遗传 * 项目来源： 基金项目， 湖南省科技厅资助项目 （2007NK2003）； 长沙市科技局重点科技项目 （K0803266-21）。 作者简介： 陈裕新 （1987-）， 男， 在读硕士研究生， 研究方向为药用植物资源工程。 E-mail: hotdogchenyuxin@163.com ** 通讯作者： E-mail: xiazhilan@sohu.com 收稿日期： 2011-03-29 第 30 卷 第 3 期陈裕新等： 灵芝单核和双核菌丝培养条件的比较研究19 多样性分析的重要材料[4-7]。 目前， 国内外对灵芝的栽培、 药理作用研究较多， 但对灵芝的孢子萌发、 杂交育种及其单核、 双核菌丝的遗传特性研究较少， 本文就灵芝单核菌丝与双核菌丝的生长特性进行比较试验， 为灵芝杂交育种提供理论依据和技术指导， 为灵芝的基础生物学研究提供实验借鉴。 材料与方法 试验材料 试验材料美国灵芝 （Ganoderma americanense）， 由湖南农业大学食用菌研究所提供。 试验方法 采用钟罩法 （子实体弹射法）[8]收集无菌孢子， 配置无菌孢子悬浮液， 并梯度稀释到光学显微镜 100×视野下只有 2 个~3 个孢子， 最后直接涂布至平板， 置于 28℃下暗培养， 获得单个孢子萌发菌落。 经光学显微镜观察均无锁状联合， 为单核菌株， 随机抽取 6 个单核菌株， 并依次编号为 P1 （Primary）、 P2、 P3、 P4、 P5、 P6。 将母种的双核菌株标记为 S （Secondary）。 固体培养基配方 （培养基 1）： 马铃薯 200 g、 葡萄糖20 g、 磷酸二氢钾 1 g、 硫酸镁 0.5 g、 琼脂 20 g， 水 1 000 mL， pH 值 6.5 。 液体培养基配方 （培养基 2）： 马铃薯 200 g、 葡萄糖 20 g、 磷酸二氢钾 1 g、 硫酸镁 0.5 g、 蛋白胨 2 g、 酵母膏 2 g， 水 1 000 mL， pH 值 6.5 。 固体平板培养， 每个菌株接 10 个培养皿， 设置 3 个重复， 接种后置于 22℃下暗培养。 液体培养， 采用 250 mL 三角瓶， 每瓶装液 150 mL， 每个菌株接 5 瓶， 设置 3 个重复。 接种后放在 22℃下静置24 h 后， 转入摇床培养。 单核、 双核菌株在平板上的延伸直径 将 7 个不同菌株接种于培养基 1。 培养 10 d 后用量尺测量菌株在培养皿中延伸的直径大小。 单核、 双核菌株在平板上的吐水数及平均直径 将 7 个不同菌株接种于培养基 1。 培养 15 d 后在光学显微镜 100×视野下观察， 记录每个视野下菌株的吐水数量和平均直径， 并按球体体积公式计算出平均每个视野下吐水的总体积 （V）， 公式为： V = nd3π/6 注： n 为吐水数量； d 为平均直径。 单核、 双核菌株在液体培养中的菌丝产量 将 7 个不同菌株接种于培养基 2。 22℃、 120 r·min-1黑暗摇瓶培养。 7 d 后纱布过滤收集菌丝， 50℃下烘干称重。 单核、 双核菌株的液体培养温度试验 将 P4、 S 两个不同菌株接种于培养基 2。 设置 19℃、22℃、 25℃、 28℃四个摇床培养温度梯度， 120 r·min-1 黑暗培养。 摇瓶培养 7 d， 纱布过滤收集菌丝， 50℃下烘干称重。 单核、 双核菌株的液体培养 pH 值试验 培养基 2 中 pH 值设置 5、 6、 7、 8、 9 共 5 个梯度， 接种 P4、 S 两个不同菌株。 22℃、 120 r·min-1 黑暗培养。 7 d 后纱布过滤收集菌丝， 50℃下烘干称重。 单核、 双核菌株的液体培养光照试验 将 P4、 S 两个不同菌株接种于培养基 2。 在 22℃ 、120 r·min-1， 0、 500 lx、 1500 lx 三个光照强度梯度培养。 7 d 后纱布过滤收集菌丝， 50℃下烘干称重。 结果与分析 单核、 双核菌株在平板上的延伸直径 不同菌株在培养皿平板上的生长情况比较见表 1。 表 1 不同菌株在培养皿平板上的生长情况比较
由表 1 可知， 双核菌株 S 的延伸直径最长， 为 7.26 cm； 各单核菌株延伸直径都远小于双核菌株， 其中 P4 菌株延伸最长， 为 5.94 cm。 菌株延伸直径由大到小排列依次为 S＞P4＞P1＞P6＞P5＞P2＞P3。 单核菌丝 P1 菌丝最浓厚， P4 最薄。 除单核菌株 P1 有较多气生菌丝外， 其余都为匍匐生长。 双核菌丝在固体培养基中的生长总体趋势强于单核菌丝， 但菌丝浓密程度与单核菌丝差异不大， 这可能由于单核菌丝的分枝能力较强， 分枝生长的速率抵消了部分双核菌丝的生长速度。 因此从形态上观察， 菌丝浓密程度没有太大差异 （参看图 4）。 单核、 双核菌株在平板上的吐水数及平均直径 不同菌株在培养皿平板上的吐水情况比较见表 2。 表 2 不同菌株在培养皿平板上的吐水情况比较
平均总体积（×10-3）/mm3 1.669 4.744 2.768 8.964 6.722 5.659 9.382 由表 2 可知， 双核菌株 S 的平均吐水数最少， 仅为 11.3 个； 各单核菌株的平均吐水数远多于双核菌株， 其中单核菌株 P4 最多为 95.7 个。 水珠平均直径以单核菌株 P3 的最大， 为 68.2 μm， 双核菌株 S 次之； 各菌株间直径大小差异较大。 平均总吐水体积以单核菌株 P6 最多， 为 9.382×10-3 mm3， 其次单核菌株 P3， 最少的为双核菌株。试验表明， 单核菌丝对水分极其敏感， 水分过多就立即以吐水的方式向外排水， 单核菌丝对氧气的需要要敏感于双核菌丝 （参看图 5）。 单核、 双核菌株在液体培养中的菌丝产量 不同菌株在液体培养中的菌丝产量比较见表 3。 由表 3 可知， 菌丝产量由高到低依次为 S＞P4＞P6＞P5＞ 20中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA30 No．3
菌株S 菌丝产量/（g·瓶-1） 0.3833 0.1500 0.2333 0.1967 0.3567 0.3275 0.3433 P2＞P3＞P1。 其中， 双核菌株 S 的液体培养产量最高， 为0.3833 g·瓶-1； 其次为单核菌株 P4， 产量为 0.3567 g·瓶-1；单核菌株 P1 最低， 为 0.15 g·瓶-1。 试验表明， 双核菌丝在液体培养中的生长势强于单核菌丝， 各单核菌丝间生长势差异较大， 也说明各单核菌株间存在较大遗传差异。 单核、 双核菌株的液体培养温度试验 不同液体培养温度处理对单核、 双核菌丝产量的影响见图 1。
双核菌株 S 在温度 22℃时， 菌丝产量最高， 为 0.3650 g·瓶-1， 是其最适生长温度。 而单核菌株的最适生长温度则为 25℃， 菌丝产量为 0.3533 g·瓶-1。 由图 1 的变化幅度可知， 单核菌丝对温度变化感应比双核菌丝的敏感， 产量随温度变化较大。 试验表明， 单核菌丝对温度变化敏感于双核菌丝。 单核、 双核菌株的液体培养 pH 值试验 不同液体培养 pH 值处理对单核、 双核菌丝产量的影响见图 2。
双核菌株 S 在 pH 值为 5 时， 菌丝产量最高， 达到了0.4833 g·瓶-1。 而单核菌株的最适生长 pH 值则为 6， 菌丝产量为 0.42 g·瓶-1。 由图 2 的变化幅度可知， 单核菌丝对pH 值变化的感应比双核菌丝的敏感， 产量随 pH 值变化较大。 试验表明， 单核菌丝对 pH 值变化敏感于双核菌丝。 单核、 双核菌株的液体培养光照试验 不同液体培养光照处理对单核、 双核菌丝产量的影响见图 3。 由图 3 可知， 单核、 双核菌株最适宜的光照强度都为0， 产量均达到最高值， 分别为 0.3867 g·瓶-1 和 0.38 g·瓶-1，即黑暗都有利于菌丝生长， 光照对菌丝生长有抑制。 由图3 变化幅度看出， 随着光照增加， 双核菌株产量递减程度要大于单核菌丝， 即光照变化对双核菌株的影响比单核菌株大， 双核菌丝对光照更为敏感。 不同菌株在平板上的生长情况见图 4~图 7。
小结与讨论 单核、 双核菌株在平板上的延伸直径和液体培养中的菌丝产量 2 个实验中， 多个单核菌株间生长速度和生长势出现了一定程度差异性， 这与何培新[9]、李荣春[10]等在研究单核菌株时所出现菌株间差异性结果相似。 这可能由于在双核菌丝减数分裂形成孢子过程中， 遗传物质再次分配， 出现不同基因型， 从而表现出较大的差异性。 此外， 2 次试验的菌株生长速度和生长势大小排列顺序基本一致， 只有 P1 出现了较大偏差， 这可能由于 P1 菌株具有较多的气生菌丝， 生长过程中需要较多氧气， 而在液体培养中由于供氧较少， 氧气便成为其生长的最大影响因素， 因此液体培养菌丝产量较低， 而固体培养中菌丝生长最快。 （下转第 23 页） 第 30 卷 第 3 期王 芳等： 木耳菌糠袋栽滑菇配方研究23
程度的降解， 而粗蛋白和粗脂肪的含量都高， 同时还产生多种有机酸和生物活性物质， 所以利于菌丝的吸收和利用， 菌丝生长快； 但当木耳菌糠添加量为 55％～65％ 时， 菌糠所占比例太大， 其营养成分缺乏， 即不利于菌丝生长。 对照 （CK） 与菌糠添加量是 25％～45％时， 袋中的营 养成分充足， 利于子实体的生长， 并且出菇整齐； 但当木耳菌糠添加量为 55％～65％时， 营养成分不足导致出菇不整齐。 从生物学效率来看， 对照 CK 最好， 生物学效率 86.7%， 但从成本和生态效益考虑， 配方 4 （ 生物学效率 82.4%） 袋栽滑菇具有可行性。 菌糠的合理利用延长了物质循环链条， 实现了经济、生态和社会的高度统一， 在食用菌的发展中具有重要的意义， 菌糠再利用栽培食用菌， 既可解决废弃菌糠带来的环境污染问题， 又可充分利用资源而节约栽培成本[8，9]，因此用木耳菌糠栽培滑菇是一条可行且值得推广之路。 [参考文献] 常明昌. 食用菌栽培（第二版）[M]. 北京： 中国农业出版社， 2009. 陈士瑜. 珍稀菇栽培与加工[M]. 北京： 金盾出版社， 2002. 龚振杰， 赵桂云. 木耳菌糠袋栽平菇技术[J]. 北方园艺， 2009 (3)： 214-215. 王凤霞， 米青山. 菌糠栽培鸡腿菇高产配方筛选初报[J]. 食用菌， 2003 (5)： 25-26． 胡文华. 怎样用菌糠栽培 EC05 鸡腿菇[J]. 吉林农业， 2003 (5)： 36-36. 常明昌. 食用菌栽培学[M]. 北京： 中国农业出版社， 2003. 黄毅. 食用菌栽培 （第三版） [M]. 北京： 高等教育出版社， 2008. [8] 郑林用， 黄小琴， 彭卫红. 食用菌菌糠的利用[J]. 食用菌学报， 2006， 13 (1)： 74-75. 侯丽娟， 代祖艳， 韩丹丹， 等. 菌糠的营养价值及在栽培上的应用[J]. 北方园艺， 2008 (7)： 91-93. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! （上接第 20 页） 在水分、 温度、 pH 值的差异方面， 单核菌丝适应能力都弱于双核菌丝。 但在光照试验中， 单核菌丝对光照变化的适应性上要强于双核菌丝， 双核菌丝对光照更为敏感， 这可能由于双核菌丝在形成子实体过程中具有对光照的感性， 而单核菌丝则没有或不强。 在单核菌丝结合形成次级菌丝过程中， 增强了对光照的敏感性， 用来加强子实体原基形成对外界环境因素的感应能力； 因此适量光照处理可诱导一些食用菌子实体原基形成。 单核菌丝生长势总体弱于双核菌丝， 表现在对环境因素变化的适应能力[11，12]。自然界许多植物都有吐水现象， 当土壤水分充足， 空 气潮湿， 无风且温度较低的天气， 未受伤的植物可从叶尖、 叶缘部位的水孔向外溢出液滴， 叫做吐水现象[13]。 大型真菌菌丝体中吐水现象比较少见， 通过显微观察手段才能清晰看到吐水现象。 单核、 双核菌丝均能在一定条件下吐水， 单核菌丝对水分更敏感， 因此吐水现象更频繁。 灵芝单核菌株与双核菌株在水分、 温度、 pH、 光照上都存在较大生理形态差异， 双核菌株对环境适应能力要强于单核菌株。 [参考文献] 林志彬， 赵大明， 许瑞祥， 等. 灵芝的现代研究 （第三版）[M]. 北京大学医学出版社， 2007. 杨新美. 中国食用菌栽培学[M]. 北京： 中国农业出版社， 1988. 黄年来. 中国食用菌百科[M]. 北京： 中国农业出版社， 1993. 潘迎捷， 陈明杰， 汪昭月， 等. 香菇交配型基因的遗传研究Ⅱ香菇孢子单核体和原生质单核体形态与生化性状上的差异[J]. 食用菌学报， 1997， 4 (2)： 1-4. 姚方杰， 李玉. 金顶侧耳交配型系统特性的研究[J]. 吉林农业大学学 报 ， 2002， 24 (2)： 61-63. Gupta B, Niranjan Reddy BP, Kotasthane AS. Molecular characteriza- tion and mating type analysis of oyster mushroom ( Pleurotus spp.) us- ing single basidiospores for strain improvement [J]. World J Microbiol Biotechnol, 2010 (6)： 10-12. CHENG Shui-ming, LIU Fan-xue. Genetic analysis of distorted segre- gation ratio of mating types among basidiospores in Lentinula edodes [J]. Agricultural Sciences in China, 2008, 7 (4) : 415-422. 李荣同， 龚光禄， 包水明， 等. 菌核侧耳担孢子收集及萌发条件 [J]. 食用菌学报， 2010， 17 (1)： 44-47. 何培新， 申进文， 罗信昌， 等. 木耳孢子单核菌株培养性状多态性研究[J]. 食用菌学报， 2003， 10 (2)： 1-4. 李荣春. 双胞蘑菇 96.4 菌株及单孢菌株在生长、 结实和杂交方面的变异[J]. 云南大学学报： 自然科学版， 2001 (23)： 21-27. 刘明月， 何长征， 谭金莲， 等. 光质对金针菇子实体生长发育的影响[J]. 中国食用菌， 1997， 6 (16)： 11-12. 张桂香， 李彬. 日光温室内不同光照强度对食用菌生长发育的影响[J]. 甘肃农业大学学报， 1999， 3 (34)： 291-295. 卞勇， 潘晓琳. 植物吐水现象的观察[J]. 植物杂志， 1995 (5)： 38. |
