培养基成分对灵芝菌株液态培养分泌漆酶酶活的影响

培养基成分对灵芝菌株液态培养分泌漆酶酶活的影响

曾璐漫^1,2，康信聪^1,2，周荣辉¹，罗 坤³，刘东波^1,2*   

（1、湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；

2、国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南 长沙 410128；

3、湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128）

摘   要 灵芝具有巨大的潜在漆酶生产能力，本研究通过采用ABTS法测定灵芝漆酶的酶活比较液体发酵培养基中不同培养基成分对灵芝菌株漆酶酶活的影响。结果显示：PDB加富培养基、Cu²⁺培养基诱导漆酶最大酶活期提前；PDB加富培养基有利于灵芝菌丝的前期生长及漆酶的产生，秸秆粉对漆酶酶活诱导作用最大、Cu²⁺培养基次之，Ca²⁺对本试验菌株没有明显的影响。

关键词   灵芝 漆酶 培养基 ABTS法

漆酶是一类含铜多酚氧化酶^[1]，具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，可以氧化酚类、芳胺类、羧酸类、甾体激素与生物色素、金属有机化合物和一些非酚类物质，且副产物只有水，被誉为“绿色酶”。漆酶不仅在生物制浆、生物漂白以及有毒化合物的降解等方面有重要的应用前景，而且在合成工业、生物检测、染料降解等方面也具有潜在的应用前景^[2]。漆酶最早从漆树的分泌物中发现，在自然界中主要分布于真菌^[3]和植物^[4]中，此外少量分布于昆虫^[5]和细菌^[6] 中。分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌亚门(Basidiomycotina)、子囊菌亚门(Ascomycotina)及半知菌亚门（Deuteromycotina）等高等真菌，其中最主要的是担子菌亚门的白腐菌^[7]。

基金项目：国家“973”项目（2012CB723004）

作者简介：曾璐漫，硕士研究生， saytothesky@163.com.

灵芝(Ganoderma lucidum)是隶属于真菌门、担子菌纲、多孔菌科、灵芝属的白腐真菌。本课题组经灵芝基因组全测序发现，灵芝不仅含有大量合成灵芝三萜等重要有效生物活性成分的基因，还具有大量分解木质素的漆酶合成基因^[8]，说明灵芝具有巨大的潜在漆酶生产能力。漆酶因其作用底物广泛、催化活性强，提高漆酶产量是其目前的研究热点问题。为了提高漆酶产量，降低生产成本，本文初步探讨了不同的培养基成分对灵芝菌株漆酶产量的影响，为进一步研究及工业化生产提供理论依据。

1   材料与方法

1.1   供试菌株

灵芝单倍体菌株，国家中医药管理局亚健康干预技术实验室保存菌种。

1.2   培养基的配制

（1）基础培养基：PDB培养基（马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、水1000ml），pH 6.5；

（2）PDB加富培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄•7H₂O 1.5g、蛋白胨2g、酵母膏2g、1000ml水、pH 6.5；

（3）Cu²⁺诱导培养基，Ca²⁺诱导培养基：在基础培养基中分别加入CuSO₄（Cu²⁺终浓度150μmol/L）、CaCl₂（Ca²⁺终浓度150 μmol/L）；

（4）秸秆粉诱导培养基：在基础培养基基础上加入秸秆粉末(80目）20g/L。

1.3   接种与发酵培养

于超净工作台内，将灵芝试管菌种接种于各组培养基中，每个三角瓶接种2块同等大小的菌丝块，24℃，150r/min恒温振荡，避光培养。

1.4   粗酶液的获取

分别于每一处理组菌株培养的第2、4、6、8、10、12、14d取培养基样本5ml（三重复）， 4000 r/min离心30min后取上清液，即粗酶液。

1.5   漆酶活性的测定

以2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）为底物，在3 ml的反应体系中加入1.7ml 0.1 mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5.0），1.2 ml的0.03%（w/v）ABTS溶液，以及0.1 ml的粗酶液；于室温25℃，420 nm（ABTS的摩尔消光系数=3.6×10⁴ mol^-1• cm^-1）处于吸光值0.2--0.8间测定吸光值，每15s读一次，读值6次，记录数据。酶活定义为1 min内催化氧化1 μmol ABTS所用的酶量为1个单位酶活（U）。

2   结果与分析

在灵芝单倍体菌株生长的第2、4、6、8、10、12、14d分别获取基础培养基组、PDB加富培养基、Cu²⁺诱导培养基组、Ca²⁺诱导培养基组、秸秆粉诱导培养基组的粗酶液，测得各组酶活，取平均值绘制各处理组与基础培养基组灵芝漆酶酶活动态曲线图。

2.1   PDB加富培养基

灵芝菌株培养在基础培养基中培养至第6天时漆酶酶活达到最高，均值为5. 71U/ml；培养于PDB加富培养基中第2天时漆酶酶活达到最高，均值为12.68U/ml，相对基础培养基组灵芝菌株的漆酶酶活提高了2.22倍。在培养初期，PDB加富培养基中富含N源及微量元素，有利于菌丝的生长，这可能是PDB加富培养基在培养初始阶段（第2d）漆酶酶活明显高于基础培养基及其它诱导组的原因。

图1.PDB加富培养基组漆酶酶活

2.2   Cu²⁺诱导培养基

由图2可知，与基础培养基比较，Cu²⁺诱导培养基的漆酶酶活在所有取样时间点均高于基础培养基，且在第4天时达到最高（21.38U/ml），是基础培养基的3.74倍。说明Cu²⁺对漆酶的合成与分泌具有诱导作用。

漆酶属于含铜的多酚氧化酶。无论是从漆酶结构还是理化性质来看，漆酶酶活都与Cu²⁺有着密切的联系。Baldrian等^[9]研究多种重金属对平菇（Pleurotus ostreatus）漆酶活性的影响显示在培养基中加入浓度为0.5~ 5.0 mmol/L的Cu²⁺可使其漆酶活性增加8倍。Galhaup等^[10]发现1 mM的Cu²⁺能诱导Trametes spp.漆酶酶活增大。Cu²⁺的参与不仅促进了漆酶的合成，并且增强了漆酶在细胞外环境中的稳定性，从而提高漆酶活性，这一现象普遍存在于真菌中。本试验的

Cu²⁺浓度较所报道的较小，可能是由于所使用的菌株不一样。

        图2. Cu²⁺诱导培养基

2.3   Ca²⁺诱导培养基

Ca²⁺诱导培养的灵芝菌株漆酶酶活与基础培养基相差不大，仅在第4天高于基础培养基，达8.23U/ml，是基础培养基组最高酶活的1.44倍。据李鑫^[11]报道，Ca²⁺对漆酶活性具有微弱的抑制作用，但本实验仅在第10天以后才有微弱的抑制，这可能是由于(1)大多使用的菌种不同。不同的菌种对营养要求及其次生代谢产物形成的特点也会有差异。(2)使用的基础培养基不同。同一种真菌在不同的培养基中其生长状态和产酶能力相差很大。

图3. Ca²⁺诱导培养基

2.4   秸秆粉诱导培养基

秸秆粉诱导培养基中培养的灵芝菌株在第6天其漆酶活性达到最高，均值为154.70U/ml，是基础培养基组最高酶活的27.09倍。漆酶的合成通常发生在真菌生长后期营养缺乏的次级代谢阶段，所以在限制碳源、氮源培养基中能大量诱导产生漆酶^[12]。侯红漫等^[13]在研究白腐菌Pleurotus ostreatus 漆酶产生条件时发现限制氮源培养有利于漆酶的分泌。在培养基中加入秸

秆等木质素，限制碳源、氮源是显著提高漆

酶产量的重要途径^[14]，这在本实验研究中也得到了相应的验证。

图4. 秸秆粉诱导培养基

3   讨论和小结

本试验在基础培养基的基础上加入各因子（PDB加富培养基、Cu²⁺诱导培养基、Ca²⁺诱导培养基、秸秆粉诱导培养基），以基础培养基作为对照，研究灵芝单倍体菌株生长过程中这四种因子对漆酶酶活的影响，结果见表1。

表1.四种因子对漆酶酶活影响

通过对灵芝菌株不同液体培养基配方培养的菌株漆酶酶活的测定发现：PDB加富培养基、Cu²⁺培养基诱导漆酶最大酶活期提前；PDB加富培养基有利于灵芝菌丝的初期生长及漆酶的产生；秸秆粉诱导培养基对漆酶酶活诱导作用最大、Cu²⁺培养基次之；Ca²⁺诱导培养基对本试验菌株没有明显的影响。

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