虫草素高产菌株的筛选及不同添加物对虫草素产量的影响研究发表时间：2023-08-28 09:38 虫草素高产菌株的筛选及不同添加物对虫草素产量的影响研究 王蕾1,2 罗巍1,2 胡瑕1,2 刘东波1,2* 夏志兰1,2 谢红旗1,3* 1湖南农业大学园艺园林学院 湖南 长沙 410128 摘 要：通过对14株蛹拟青霉菌株进行摇瓶液体发酵培养试验，筛选虫草素产量最高的蛹虫草菌株，并确定了虫草素的最佳收获期；比较8种营养添加物对虫草发酵过程中虫草素积累的影响，筛选出最佳的营养添加物，以提高液体发酵生产虫草素的产量。结果表明：蛹虫草CM001号菌株的虫草素产量最高，蛹虫草菌在第10天细胞量达到最大值20.44mg/mL，虫草素含量在第13天达到最大值73.81mg/L，70%以上的虫草素分布在发酵液中。其中分别添加腺苷、腺嘌呤、丙氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸5种物质，对虫草素合成的促进作用均较明显，均能有效提高蛹虫草液体发酵虫草素的产量，特别是添加1g/L的腺嘌呤能使10号菌株的虫草素产量提高7.09倍。 关键词：蛹虫草，虫草素，添加物，培养基优化 Screening of high-yeild strain and medium optimization for maximum production of cordycepin by Cordyeps militaris WANG Lei1,2 LUO Wei1,2 HU Xia1,2 LIU Dong-Bo1,2* XIA Zhi-Lan1,2 XIE Hong-Qi1,3* 1College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China Abstract: In order to screen high-yield strain and determine the best harvest time of cordycepin, 14 Cordyceps militaris strains was tested by shaking flask fermentation. The effect of 8 different kinds of nutrient additives on the dynamics of cordycepin accumulation were compared. The results showed that C. militaris CM001 strain produced the highest amount of cordycepin. The biomass of C. militaris reached the maximum of 20.44mg/mL at the 10th day while the maximum cordycepin content reached 73.81mg/L at the 13th day. Seventy percent of cordycepin was in the fermentation broth. Additions of adenosine, adenine, alanine, glycine, and L-aspartic acid considerably increased the cordycepin production in the submerged culture, especially the addition of 1g/L adenine which increasing the cordycepin production by 7.09-fold than the control. Key words: Cordyceps militaris, cordycepin, additives, medium optimization 虫草素（cordycepin）又称虫草菌素、蛹虫草菌素，是蛹虫草中（尤其是核苷类）主要活性成分，是第一个被分离出的核苷类抗生素（杨涛和董彩虹 2011）。虫草素具有多种生物活性，有抗菌（黄冕和张松等 2010；林群英等 2006）、降血脂（朱平等 2003）、减肥（Kim et al. 2009）、抗肿瘤（康冀川等 2011）和抗癌（Overgaard- hansen 1964）等作用。 蛹虫草是主要产虫草素的菌株，但其子实体生长周期长，产量低，虫草素的含量也比较低，从子实体中提取虫草素成本极高，价格昂贵，很难满足临床的广泛使用（刘艳芳等 2010）。目前蛹虫草已实现了大规模深层发酵，但对蛹虫草的液体发酵研究主要集中在发酵条件的优化及有效成分的检测方面（程红艳等 2011；栾兰等 2010；Mao et al. 2005；Mao & Zhong 2006）。而对于发酵过程中有效成分的动态积累研究甚少，蛹虫草发酵培养时间也参差不齐。工业生产中，一般既要获得目标产物的最大量，还要节省生产成本。本论文研究了蛹虫草发酵过程中虫草素的动态积累情况及添加虫草素合成的前体物对蛹虫草液体深层发酵生产虫草素的促进作用，旨在为进一步提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素的产量提供参考。 1 材料与方法 1.1 菌种来源、仪器和试剂 1.1.1 供试菌株：蛹虫草6号、7号、9号、10号、11号、13号、14号、15号、16号、17号、18号、19号、20号、CM001号菌种由湖南农业大学食用菌研究所提供。 1.1.2 仪器：Prominence UFLC-20A（日本岛津公司），PL602-S电子精密天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，LDZX-50FAS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），SW-CJ-2F双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司），ZHWY-2102C恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司），KA-1000台式离心机（上海安亭科学仪器厂），DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。 1.1.3 基础培养基：菌种活化培养基（PDA）：马铃薯200g煮沸过滤取汁，葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，蛋白胨2g，酵母膏1g，琼脂20g，水1,000mL，pH值自然。蛹虫草液体母种培养基和液体发酵基础培养基均为：葡萄糖 3.6%、蛋白胨0.4%、酵母膏0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO4 0.1%、水1,000mL，pH值自然，121℃灭菌30min。 1.1.4 试剂：虫草素标准品（Sigma公司），腺嘌呤，甘氨酸，L-天冬氨酸，腺苷组合及其他试剂均为分析纯。 1.2 方法 1.2.1 接种培养：在超净工作台上按无菌操作接入供试蛹虫草菌种，接种完后于25℃静置1d，之后放入振荡培养箱，在25℃、140r/min条件下培养。 1.2.2 样品预处理：从培养的第3天至第2113天每天取样品3个，倒出瓶中的菌丝体及培养液，用双层纱布过滤，分离菌丝体和培养液。菌丝体用蒸馏水清洗2次，冷冻保存。培养液用滤纸过滤后置于冰箱保存待测。 1.2.3 生长量的测定：将经预处理的菌丝体放置于恒温干燥箱，于40℃下烘至恒重。用电子天平称重，取3个平行样的平均值，即得生长量。 1.2.4 菌种的选择：按1.2.1操作，依次接种CM001等14株蛹拟青霉菌株，每个菌种接种3瓶，培养2014d，倒出瓶中的菌丝体及培养液。菌丝体用蒸馏水清洗2次，冷冻保存。培养液用滤纸过滤后置于冰箱保存待测。选取虫草素产量最大的菌种进行接种下一步试验。 1.2.5 添加添加前体物培养：分别添加腺嘌呤、甘氨酸、腺苷、L-天冬氨酸、肌苷、丙氨酸、鸟苷、半胱氨酸8种添加物到配好的培养基中分别添加腺嘌呤、甘氨酸、腺苷、L-天冬氨酸4种前体物到配好的培养基中，添加量为1g/L，接种菌株为10号和CM001号菌株，培养13d，分别测定菌丝体与发酵液中虫草素含量。 1.3 虫草素测定 虫草素的测定采用高效液相色谱法（张红霞等 2005）。 1.3.1 色谱条件：色谱柱：Shim-pack vp-ODS（4.6mm×150mm，5μm），流动相：V（水）:V（甲醇）=85:15，流速0.8mL/min，检测波长260nm，进样量10μL，温度35℃。 1.3.2 虫草素测定：待液体发酵培养至第13天，在摇床上取出培养物，经抽滤后定容到100mL，对每个样品进行取样待测。抽滤后的菌丝体置于烘箱中干燥，烘干后，称量菌丝体的总重量。菌丝体加液氮研磨成粉末，称取0.1g加入2mL纯净水，超声波100W、60℃处理50min，4,000r/min离心10min，取上清液，重复提取3次，合并上清液待测。菌丝体提取液和发酵液直接过0.45μm滤膜后，采用高效液相色谱检测虫草素含量。 2 结果与分析 2.1 高产菌株的筛选 本研究检测了蛹虫草不同菌株的发酵液和菌丝体中虫草素含量，不同菌株的发酵液和菌丝体中虫草素产量如表1所示。在蛹虫草液体发酵过程中，不同蛹虫草菌株在相同液体发酵培养条件下虫草素产量不一样，菌株CM001号的发酵液和菌丝体的虫草素总产量最高，所以筛选出高产菌株为CM001号蛹虫草菌种。 2.2 蛹虫草发酵过程中生物量的变化情况 试验测量了CM001号蛹虫草菌种从第3天至第21天液体发酵过程中的生长量，蛹虫草不同发酵时间生物量的变化情况如图1所示。生物转化量从第3天至第10天处于一个快速上升的阶段，在第10天基本达到一个最大值，在10－14d，生长量处于一个稳定的、不再上升的阶段。从第15天开始菌丝生长量呈下降趋势，原因可能是菌株在有限的营养浓度内，菌丝体达到最大增长限度后，由于缺乏营养，自身开始产生或外溢一些代谢副产物和中间产物，并伴随着菌丝体自溶现象所致。试验结果表明生长量的积累并不是随着培养天数的增加而不断上升，而是在某一时间达到一个最大值后不再上升基本保持稳定，因此采收菌丝体的最佳培养天数为10d。 试验检测了第3天到第21天蛹虫草液体发酵培养过程中每天发酵液和菌丝体中虫草素含量的变化，不同培养时间发酵液和菌丝体中虫 表1 不同菌株发酵液和菌丝体中虫草素的积累量 Table 1 Cordycepin production of different strains of Cordyceps militaris in the fermentation broth and mycelia
图1 蛹虫草不同发酵时间生物量变化曲线 Fig. 1 The biomass curves of Cordyceps militaris in different fermentation period. 草素含量及产量变化如图2所示。在蛹虫草液体发酵过程中，从第4天开始，发酵液中的虫草素积累量大于菌丝体中虫草素积累量。第8天后，发酵液中虫草素产量是菌丝体中虫草素 产量的2.5倍以上，即70%以上的虫草素分泌在发酵液中。而虫草素在发酵液和菌丝体中的产量分别都在13d达到最大值73.81mg/L和1.41mg/g。第13天后，虫草素产量虽然略有增加，但是比之13d总产量增加不到1%。所以综合考虑，以生产虫草素为目的的液体发酵，最佳培养时间为13d。 2.4 不同添加物对虫草素积累影响情况 试验检测了10号、CM001号两种蛹虫草菌株在第13天的发酵液和菌丝体中虫草素产量，在培养基中添加不同前体物及营养物质的发酵液和菌丝体中虫草素产量如表2和表3所示。在液体培养基中加入前体物及营养物质，腺苷、腺嘌呤、丙氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸5种物质对两种菌株所产虫草素都有较大程度提高，尤其腺嘌呤的效果最明显。在CM001号菌株蛹虫草液体培养过程中，添加了腺嘌呤的液体发酵后的发酵液和菌丝体的虫草素总产量最大，是空白添加物的5.57倍。在10号蛹虫草液体培养过程中，添加腺嘌呤的培养基中发酵液和菌丝体的虫草素总产量也是最大，达到了659.48mg/L，是空白添加物的7.09倍。添加腺嘌呤对不同的菌株中虫草素含量的积累程度虽然有所不同，但提高虫草素产量的效果明显优于其他添加物；而肌苷、鸟苷、半胱氨酸3种物质对虫草素的合成有抑制作用，添加了这3种物质的液体培养基中虫草素的产量都出现大幅下降，其中肌苷、鸟苷使虫草素的产量下降了40%。
图2 不同培养时间发酵液和菌丝体中虫草素的积累变化曲线 Fig. 2 Accumulation curves of cordycepin in the broth and mycelia in different fermentation period. 表2 不同添加物对CM001号菌株虫草素积累量的影响 Table 2 The effect of different nutrient additives on cordycepin production by Cordyceps militaris CM001 strain
表3 不同前体添加物对10号菌株虫草素积累量的影响 Table 3 The effect of different nutrient additives on cordycepin production by Cordyceps militaris No. 10 strain
3 讨论 本研究通过对14种蛹拟青霉菌株的液体发酵培养，检测发酵液与菌丝体中的虫草素的产量，比较得出CM001号与10号菌株是液体发酵培养高产虫草素的优良菌株。 初级代谢产物的产量往往与生物量呈正相关，而次级代谢产物的积累不一定与生物量呈正相关。虫草素作为北冬虫夏草的次级代谢产物，本试验通过在发酵液及菌丝体不同生长时期测定其中虫草素含量的结果发现，菌丝体大量合成时，培养液体中虫草素含量一直处于较低水平，而在营养成分大部分耗尽的10d后虫草素大量合成，并且在培养基中大量积累，这与刘艳芳等（2010）的研究结果一致。但随着时间的延长，在虫草菌生物量的衰退期，虫草素也有少量增加，但是增加量也不到总产量的1%，这与罗巍等（2011）的研究一致，而且做为次级代谢产物，70%以上的虫草素都分布在发酵液中。本研究通过对蛹虫草CM001号菌株的液体发酵培养，并最终确定了以虫草素为生产目的的液体发酵的最佳发酵周期为13d。 通过对蛹虫草10号、CM001号菌株进行液体培养，比较研究了不同营养添加物对虫草素产量的影响，添加腺嘌呤、丙氨酸、腺苷、L-天冬氨酸、甘氨酸5种前体均能提高蛹虫草液体发酵胞内外虫草素的产量，特别是添加1g/L的腺嘌呤能大幅提高胞外虫草素产量，蛹虫草10号的虫草素总产量提高7.09倍。营养添加物研究发现腺嘌呤与腺苷均能提高虫草素产量，这两种化合物在虫草素的合成中所发挥的作用基本相同，而细胞利用腺嘌呤的速度比腺苷的速度快，且在同样的添加浓度下，腺嘌呤更有利于虫草素的合成，对虫草素产量的提高更显著。文庭池等（2009）证实，腺苷、腺嘌呤对虫草素的含量有促进作用，这与本试验结果一致。而Mina et al.（2006；2007）研究表明，添加腺嘌呤和腺苷的混合添加物，并进行循环加入液体培养基能提高虫草素产量5.5倍，而本试验只是加入1g/L的腺嘌呤就能使虫草素产量提高到7.09倍，这可能与蛹虫草人工培养存在的菌株差异，区域差异、培养条件差异及提取条件的不同有关（杨昕等 2009），导致其中的虫草素含量存在差异。在本研究中，丙氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸对蛹虫草中虫草素合成的促进作用较明显；这可能由于这两种氨基酸类物种作为一种营养物质，能影响腺苷、腺嘌呤和虫草菌素的生物合成；而鸟苷，肌苷，半胱氨酸均不能提高虫草素产量，反而对虫草素的合成有抑制作用。 [REFERENCES] Cheng HY, Guo W, Chang MC, Meng JL, Yang J, 2011. Study of optimization on liquid fermentation conditions of Cordyceps militaris mycelium. Journal of Shanxi Agricultural University, 31(1): 66-72 (in Chinese) Huang M, Zhang S, 2010. Research advances of physiological efficacies of cordycepin. Journal of Fungal Research, 8(4): 234-244 (in Chinese) Kang JC, Kang C, Wen TC, Qian YX, Lei BX, 2011. Pharmacological research progress of cordycepin. Mycosystema, 30(2): 191-197 (in Chinese) Kim SK, Kim SW, Lee SC, Kim IW, 2008. A pharmaceutical composition comprising cordycepin for the treatment and prevention of obesity. World Intellectual Property Organization. WO2008038973(Al). Lin QY, Song B, Li TH, 2006. Advances in the studies on Cordyceps militaris. Microbiology, 33(4): 154-157 (in Chinese) Liu YF, Tang QJ, Gu JJ, Zhang JS, Yang Y, Feng N, Zhou S, Wei DZ, 2010. Optimization of submerged fermentation process of Cordyceps militaris to produce a high cordycepin content. Acta Agriculturae Shanghai, 26(3): 26-30 (in Chinese) Luan L, Wang GL, Lin RC, 2010. Comparative research on HPLC fingerprint of Cordyceps sinensis and its cultured mycelia. Chinese Traditional Patent Medicine, 32(6): 893-897 (in Chinese) Luo W, Liu DB, Wu ZW, Xia ZL, Xie HQ, 2011. Study on the active components’ accumulation in Cordceps militaris throngh femention process. Food and Fermentation Industries, 37(9): 108-111 (in Chinese) Mao XB, Eksriwong T, Chauvatcharin S, Zhong JJ, 2005. Optimization of carbon source and carbon/nitrogen ratio for cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris. Process Biochemistry, 40(5): 1667-1672 Mao XB, Zhong JJ, 2006. Significant effect of NH4+ on cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris. Enzyme and Microbial Technology, 38(3-4): 343-350 Mina M, Eriko U, Hiromitsu H, Akiniko S, Mikio S, 2007. Enhanced production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris. Emzyme and Microbial technology, 40: 1199-1205 Mina, Eriko, Akihiko, Mikio, 2006. Production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris. Enzyme and Microbial Technology, 39: 641-646 Overgaard-hansen K, 1964. The inhibition of 5-phosphoribosyl- 1-pyrophosphate formation by cordycepin triphosphate in extracts of Ehrlich ascites tumor cells. Biochimica et Biophysica ActaBiochim Biophys Acta, 80: 504-507 Wen TC, Lei BX, Kang JC, Li GR, He J, 2009. Enhanced production of mycelial and cordycepin by submerged culture using additives in Cordyceps militaris. Food and Fermentation Industries, 29(8): 49-52 (in Chinese). Yang T, Dong CH, 2011. Cordycepin research and exploitation: progress and problems. Mycosystema, 30(2): 180-190 (in Chinese) Ying X, Si LQ, Tu YP, Li G, 2009. The comparison of nucleosides in cultured Cordyceps militaris mycelia from different habitats and natural Cordyceps sinensis. Herald of Medicine, 28(10): 1354-1356 (in Chinese) Zhang HX, Wu W, Chen W, Gao XH, Tang LS, 2005. Analysis of cordycepin and adenosine contents in fermentation supernatant of Cordyceps militaris by HPLC. Acta Agriculturae Shanghai, 21(4): 53-56 (in Chinese) Zhu P, Zhu HB, Zhu HX, Zhang L, He HX, Wang Q, Cheng KD, Shi JG, Yang YC, 2003. Application of 3′-deoxyadenosine in the preparation of lipid-lowering drugs. China, 200310101650.7[P]. (in Chinese) [附中文参考文献] 程红艳，郭伟，常明昌，孟俊龙，杨杰，2011. 蛹虫草菌丝液体发酵培养条件的优化研究. 山西农业大学学报，31(1): 66-72 黄冕，张松，2010. 虫草素生理功效的研究进展. 菌物研究，8(4): 234-244. 康冀川，康超，文庭池，钱一鑫，雷帮星, 2011. 虫草菌素药理学研究进展. 菌物学报，30(2): 191-197 林群英，宋斌，李泰辉，2006. 蛹虫草研究进展. 微生物学通报， 33(4): 154-157 刘艳芳，唐庆久，顾俊杰，张劲松，杨焱，冯娜，周帅，魏东芝，2010. 北冬虫夏草深层发酵高产虫草素工艺研究. 上海农业学报，26(3): 26-30 栾兰，王钢力，林瑞超，2010. 冬虫夏草与虫草发酵菌丝体的HPLC指纹图谱比较研究. 中成药，32(6): 893-897 罗巍，刘东波，吴郑武，夏志兰，谢红旗，2011. 蛹虫草液态发酵中有效成分的动态积累变化. 食品与发酵工业，37(9): 108-111 文庭池，雷帮星，康冀川，李光荣，何劲，2009. 添加前体促进蛹虫草发酵生产菌丝体和虫草菌素的研究.食品与发酵工业, 29(8): 49-52 杨涛，董彩虹，2011. 虫草素的研究开发现状与思考. 菌物学报，30(2): 180-190 杨昕，斯陆勤，涂轶平，李高，2009. 不同产地人工蛹虫草子实体及冬虫夏草中核苷类成分的比较. 医药导报，28(10): 1354-1356 张红霞，吴畏，陈伟，高新华，唐乐珊, 2005. 北冬虫夏草发酵液中虫草素和腺苷含量的HPLC分析. 上海农业学报, 2005(4): 53-56 朱平，朱海波，朱慧新，张岭，何惠霞，王全，程克棣，石建功，杨永春，2003. 3′-脱氧腺苷在制备降血脂药物中的应用: 中国, 200310101650.7[P]，2006.05.17 |
